Materyal
İzolasyonu gerçeklestirilen bitki ve memeli RNA örnekleri
Araç ve Gereçler
- Kuartz spektrofotometri küvetleri
- Spektrofotometre
- Pipet ve steril pipet uçları
- 1.5 ml mikrofüj tüpleri
Uygulama
- 1.5 ml’lik iki mikrofüj tüpü K (Kör, Blank) ve Ö (Örnek) seklinde isaretlenir.
- Örnegi içeren tüpün içerisine öncelikle 98 μl distile su, daha sonra da 2 μl RNA izolatı konularak pipet yardımıyla karıstırılır. Bu asamada 1:50 seyreltme yapılmıs olur.
- Kör tüp sadece 100 μl distile su içermektedir.
- Spektrofotometrede nükleik asitler için ölçüm yapılan 3 numaralı dosya açılır ve yapılan seyreltme ve dogrulama faktörleri gibi ayarlamalar yapılır. Kullanılan spektrofotometreye göre bu asamanın degisecegi unutulmamalıdır.
- Referans degerler K kodlu tüpten elde edilen ölçüm ile sıfırlanır. Bu asamada gerçeklestirilen solüsyondan ileri gelecek olan spektrofotometrik algılamaların sıfırlanmasıdır. Bu sekilde örnekten yapılacak ölçümlerin sadece örnek içerisinde çözülmüs molekülleri tespit etmesi saglanır.
- Ö kodlu tüpün ölçüm degerleri (260 nm, 280 nm ve saflık degerleri) laboratuvar defterine aktarılır. Alet tarafından ölçülen RNA miktarı ng/μl olarak deftere alınır.
Proteinler 280 nm’de absorbsiyon gösterdikleri için OD 260/OD 280 degeri hesaplanır. Eger bu deger 1.8-2.0 arasında ise elde edilen nükleik asitlerin temiz oldugu varsayılır.
RNA konsantrasyonu (μg/ml) = (OD260 x Seyreltme katsayısı x 40 μg/ml) / 1000
Not: Absorbansın ‘1’ degeri 1 cm3’lük küvette 50 μg/ml miktarında çift zincirli DNA’yı, 33 μg/ml tek zincirli oligonükleotidleri ve 40 μg/ml ise tek zincirli RNA’yı temsil etmektedir.
Spektrofotometri ile ölçülen 260 nm ve 280 nm degerleri kullanılarak izole edilen RNA örneklerinin konsantrasyonlarının ve saflık derecelerinin hesaplanması, karsılastırılması ve sonuçların deneysel uygulama asamaları açısından degerlendirilmesi.