ELISA
yönteminin prensibi, özgül antijen-antikor arasındaki reaksiyona dayanır.
Bu teknikte işaretsiz antijen veya antikor
tayin edebiliriz.
İşaretli konjugatın hazırlanmasında
işaretleyici olarak enzim kullanılır.
Reaksiyonun tamamlanmasından sonra ayırma
işlemi yapılır ve ortama bir substrat ilave edilerek spektrofotometrik olarak
enzim aktivitesi ölçülür.
ELISA KOMPONENTLERİ
Katı faz (Matriks): Manüel elisa
yöntemlerinde kullanılan, genellikle çukurlarına analitlerin ( antikor veya
antijen ) bağlı olduğu 96 çukurlu mikropleytlerdir.
Antikor: IgG fraksiyonlarıdır.
Enzim ve substratlar: Konjugatın
işaretlenmesinde en sık kullanılan alkalen fosfataz(AP) ve horseradish
peroksidaz (HRP) enzimleridir.
AP için BCIP/NBT ( 5-bromo-4chloro-3-fosfat
indolyl/Nitro mavi tetrazolium)
HRP için TMB ( tetramethylbenzidine )
kullanılır.
Yıkama: ELİSA yönteminde her bir safha
arasında fosfatlı tampon solüsyonu (PBS) ile yıkama işlemi önemli yer
tutmaktadır.
Durdurma: ELİSA’nın son safhası olan
‘reaksiyon durdurulması’ basamağında asidik ve bazik çözeltiler ( H2so2, HCL,
NaOH ) kullanılır.
ELİSA
Çeşitleri Nelerdir ?
Direkt
ELISA
İndirekt ELISA
Sandwich ELISA
Kompetetif ELISA
İndirekt ELISA
Sandwich ELISA
Kompetetif ELISA
Direkt ELISA
Direkt ELISA yöntemi yüksek molekül ağırlıklı antijenin miktar tayini için uygundur.
Numune içindeki antijenler nonspesifik olarak mikrotitre kabının kuyu yüzeyine bağlanır.
İşaretli antikor kuyucuklara eklenir.
Belirli sürelerde inkübe edilir.
Yapılan yıkama işlemi ile bağlanmamış işaretli antikorlar ortamdan uzaklaştırılır.
Kuyulardaki bağlanmış enzim işaretli antikor miktarı, ortama enzimin substratının eklenmesi ile oluşan renk değişimi sayesinde belirlenir.
Direkt ELISA yöntemi yüksek molekül ağırlıklı antijenin miktar tayini için uygundur.
Numune içindeki antijenler nonspesifik olarak mikrotitre kabının kuyu yüzeyine bağlanır.
İşaretli antikor kuyucuklara eklenir.
Belirli sürelerde inkübe edilir.
Yapılan yıkama işlemi ile bağlanmamış işaretli antikorlar ortamdan uzaklaştırılır.
Kuyulardaki bağlanmış enzim işaretli antikor miktarı, ortama enzimin substratının eklenmesi ile oluşan renk değişimi sayesinde belirlenir.
İndirekt ELISA
Numune içindeki antijenler mikrotitre kabının kuyu yüzeyine bağlanır.
İlk olarak işaretsiz primer antikorlar kuyulara eklenir.
Antijen ve primer antikor belirli sürelerde inkübe edilir.
Yapılan yıkama işlemi ile bağlanmayan primer antikorlar ortamdan uzaklaştırılır.
Sonrasında primer antikorlara spesifik, enzim ile işaretli sekonder antikor kuyulara eklenir.
Belirli sürelerde inkübe edilir.
Tekrar yapılan yıkama işlemi ile bağlanmayan işaretli sekonder antikorlar ortamdan uzaklaştırılır.
Son olarak enzimin substratı kuyulara eklenir ve elde edilen renk değişimi ile antikorlar belirlenir.
Numune içindeki antijenler mikrotitre kabının kuyu yüzeyine bağlanır.
İlk olarak işaretsiz primer antikorlar kuyulara eklenir.
Antijen ve primer antikor belirli sürelerde inkübe edilir.
Yapılan yıkama işlemi ile bağlanmayan primer antikorlar ortamdan uzaklaştırılır.
Sonrasında primer antikorlara spesifik, enzim ile işaretli sekonder antikor kuyulara eklenir.
Belirli sürelerde inkübe edilir.
Tekrar yapılan yıkama işlemi ile bağlanmayan işaretli sekonder antikorlar ortamdan uzaklaştırılır.
Son olarak enzimin substratı kuyulara eklenir ve elde edilen renk değişimi ile antikorlar belirlenir.
Nonkompotetif ELISA (Sandwich yöntemi)
Bu test ile bilinmeyen örneklerin içindeki antijen miktarı belirlenir.
Direkt veya indirekt ELISA ile oluşan renk değişimi antikorun varlığına işaret ederken; Sandviç ELISA da oluşan renk değişimi antijenin varlığına işaret eder.
Bu test ile bilinmeyen örneklerin içindeki antijen miktarı belirlenir.
Direkt veya indirekt ELISA ile oluşan renk değişimi antikorun varlığına işaret ederken; Sandviç ELISA da oluşan renk değişimi antijenin varlığına işaret eder.
Sandwich ELISA’ da antikorlar (yakalama
antikoru) mikrotitre kabının kuyucuklarının katı fazına immobilize edilir.
Antijeni içeren örnek daha sonra ilave edilir ve antijen-antikor kompleksinin oluşması beklenir.
Bağlanmamış proteinler yıkama basamakları ile uzaklaştırılır.
Enzim işaretli ikinci bir antikor (deteksiyon antikoru), yakalama antikoruna bağlanmış antijene farklı bir epitopundan bağlanır.
Bağlanmayan deteksiyon antikorunun yıkama işlemi ile uzaklaştırılmasından sonra, ortama enzime ait substrat eklenir.
Substrat deteksiyon antikoruna bağlı enzimle reaksiyona girerek renk değişimine neden olur.
Bu renk değişimi de spektrofotometre ile ölçülür.
Antijeni içeren örnek daha sonra ilave edilir ve antijen-antikor kompleksinin oluşması beklenir.
Bağlanmamış proteinler yıkama basamakları ile uzaklaştırılır.
Enzim işaretli ikinci bir antikor (deteksiyon antikoru), yakalama antikoruna bağlanmış antijene farklı bir epitopundan bağlanır.
Bağlanmayan deteksiyon antikorunun yıkama işlemi ile uzaklaştırılmasından sonra, ortama enzime ait substrat eklenir.
Substrat deteksiyon antikoruna bağlı enzimle reaksiyona girerek renk değişimine neden olur.
Bu renk değişimi de spektrofotometre ile ölçülür.
Renkli ürün oluşumu, işaretsiz ligandın
(serumdaki antijen veya antikor) konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.
Bu tekniğin ana avantaji, antijenin kullanılmadan önce saflaştırılmasına gereksinim olmamasidir ve sandviç ELISA çok spesifiktir.
Bu tekniğin dezavantaji ise her antikorun kullanılamamasıdır. Seçilen monoklonal antikor kombinasyonları aynı antijen üzerinde üst üste binmeden farklı epitopları tanımalıdır.
Bu tekniğin ana avantaji, antijenin kullanılmadan önce saflaştırılmasına gereksinim olmamasidir ve sandviç ELISA çok spesifiktir.
Bu tekniğin dezavantaji ise her antikorun kullanılamamasıdır. Seçilen monoklonal antikor kombinasyonları aynı antijen üzerinde üst üste binmeden farklı epitopları tanımalıdır.
Kompetitif ELISA
Mikrotitre kabının kuyucuklarının katı fazına antijen veya antikor bağlanır.
Çukurlara serum ( işeretsiz ligand içerir ) ve reaktif ( işaretli ligand içerir ) eklenir.
İnkübasyon süresince immobilize antijen veya antikora bağlanmak için işaretsiz ligand ile enzim işaretli ligand yarışırlar.
İnkübasyon ve yıkama işleminden sonra substrat eklenir.
Reaksiyon sonucu oluşan renk değişikliği, hasta örneğindeki işaretsiz ligand miktarı ile ters orantılıdır. Örnekte ne kadar az işaretsiz ligand varsa birleşen işaretli ligand miktarı da o kadar fazla olacaktır.
Sonuçlar spektrofotometrik olarak değerlendirilir.
Mikrotitre kabının kuyucuklarının katı fazına antijen veya antikor bağlanır.
Çukurlara serum ( işeretsiz ligand içerir ) ve reaktif ( işaretli ligand içerir ) eklenir.
İnkübasyon süresince immobilize antijen veya antikora bağlanmak için işaretsiz ligand ile enzim işaretli ligand yarışırlar.
İnkübasyon ve yıkama işleminden sonra substrat eklenir.
Reaksiyon sonucu oluşan renk değişikliği, hasta örneğindeki işaretsiz ligand miktarı ile ters orantılıdır. Örnekte ne kadar az işaretsiz ligand varsa birleşen işaretli ligand miktarı da o kadar fazla olacaktır.
Sonuçlar spektrofotometrik olarak değerlendirilir.
Kompetitif ELISA yöntemi, sıklıkla antikor
ölçümünde kullanılmaktadır.
