Çölde Tarım Mümkün

Kuzey Etiyopya’daki tarımcıların zorlu hava şartları ile mücadelesini kolaylaştırmak amacıyla bir şirket teknolojik bir sera sistemi icat etti.

Yeni teknolojiyle kurulan seralar gün içinde havadaki nemi ve çiğleri topluyor. Akşamüstü ise bu toplanan çiğ, suya çevriliyor. Gün içinde, yeşil evin üst bölgesine sıcak hava depolanıyor. Gece olduğunda ise soğuyan hava ile birlikte yeşil evin bacası açılıyor, soğuk havanın bacadan içeri nem vermesi sağlanıyor. Böylece yapının altına ekilen ürünler sulanıyor.

Kurak yerler için ideal Bu seralar aslında çok düşük teknolojili bir icat. Bambu, halat gibi basit malzemelerden, poli-karbonat duvarlardan ve biyo-plastik bir bacadan oluşuyor. İcadın sahibi olan şirket ise, Afrika gibi çok kurak yerlerdeki insanların tarım yapabileceğine ve mahsul elde edeceğine inanıyor. Şirket şimdiden dünyanın her yerinden ürünlerini inceleyebilmek için istek geldiğini söylüyor.

Spektrofotometre ile RNA Miktarının Hesaplanması Nasıl Yapılır ?

Materyal

İzolasyonu gerçeklestirilen bitki ve memeli RNA örnekleri

Araç ve Gereçler

• Kuartz spektrofotometri küvetleri
• Spektrofotometre
• Pipet ve steril pipet uçları
• 1.5 ml mikrofüj tüpleri

Uygulama

1. 1.5 ml’lik iki mikrofüj tüpü K (Kör, Blank) ve Ö (Örnek) seklinde isaretlenir.
2. Örnegi içeren tüpün içerisine öncelikle 98 μl distile su, daha sonra da 2 μl RNA izolatı konularak pipet yardımıyla karıstırılır. Bu asamada 1:50 seyreltme yapılmıs olur.

3. Kör tüp sadece 100 μl distile su içermektedir.
4. Spektrofotometrede nükleik asitler için ölçüm yapılan 3 numaralı dosya açılır ve yapılan seyreltme ve dogrulama faktörleri gibi ayarlamalar yapılır. Kullanılan spektrofotometreye göre bu asamanın degisecegi unutulmamalıdır.

5. Referans degerler K kodlu tüpten elde edilen ölçüm ile sıfırlanır. Bu asamada gerçeklestirilen solüsyondan ileri gelecek olan spektrofotometrik algılamaların sıfırlanmasıdır. Bu sekilde örnekten yapılacak ölçümlerin sadece örnek içerisinde çözülmüs molekülleri tespit etmesi saglanır.

6. Ö kodlu tüpün ölçüm degerleri (260 nm, 280 nm ve saflık degerleri) laboratuvar defterine aktarılır. Alet tarafından ölçülen RNA miktarı ng/μl olarak deftere alınır.

Proteinler 280 nm’de absorbsiyon gösterdikleri için OD 260/OD 280 degeri hesaplanır. Eger bu deger 1.8-2.0 arasında ise elde edilen nükleik asitlerin temiz oldugu varsayılır.

RNA konsantrasyonu (μg/ml) = (OD260 x Seyreltme katsayısı x 40 μg/ml) / 1000

Not: Absorbansın ‘1’ degeri 1 cm3’lük küvette 50 μg/ml miktarında çift zincirli DNA’yı, 33 μg/ml tek zincirli oligonükleotidleri ve 40 μg/ml ise tek zincirli RNA’yı temsil etmektedir.

Sonuçların Degerlendirilmesi ve Rapor Hazırlanması

Spektrofotometri ile ölçülen 260 nm ve 280 nm degerleri kullanılarak izole edilen RNA örneklerinin konsantrasyonlarının ve saflık derecelerinin hesaplanması, karsılastırılması ve sonuçların deneysel uygulama asamaları açısından degerlendirilmesi.

Denizler altında balon seralar

İtalya’da Okyanus Resif Grubu adında bir grup 4 yıldır sualtı seraları üzerinde çalışmalar yürütüyor. Denizin sıcaklığı ve yüksek karbondioksit oranından faydalanılarak gerçekleştirilen projede İtalya’da Noli sahilinde denizin 6 metre altında zemine demirlenmiş bir serada çilek yetiştiriliyor.

Nemo’nun Bahçesi adı verilen sera projesinde, seraların balon şeklindeki yapısı denizin sundukları ile birleşince bitki yetiştirilmesi için uygun imkânlar sağlıyor. Seraların sıcaklığı 26 °C ve nem oranı ise yüzde 83. Su altında sıcaklık sabit kalıyor. Seraların şekli sayesinde su sürekli buharlaşarak nem şeklinde bitkilerle bir araya geliyor. Ayrıca kapalı alandaki yüksek karbondioksit de bir anlamda steroid etkisi yapıyor ve bitkiler daha hızlı büyüyor. Proje, şimdiden birçok ülkenin ve grubun ilgisini çekti. Gelecekte daha yüksek teknolojiler kullanılarak sualtı seralarının ekonomik olarak sürdürülebilir hale getirilmesi amaçlanıyor.

Biyoteknoloji Bilimi

Dünyaca Karpuz

ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELİSA) Yöntemi Nedir ?

ELISA yönteminin prensibi, özgül antijen-antikor arasındaki reaksiyona dayanır.

Bu teknikte işaretsiz antijen veya antikor tayin edebiliriz.

İşaretli konjugatın hazırlanmasında işaretleyici olarak enzim  kullanılır.

Reaksiyonun tamamlanmasından sonra ayırma işlemi yapılır ve ortama bir substrat ilave edilerek spektrofotometrik olarak enzim aktivitesi ölçülür.

ELISA KOMPONENTLERİ

Katı faz (Matriks): Manüel elisa yöntemlerinde kullanılan, genellikle çukurlarına analitlerin ( antikor veya antijen ) bağlı olduğu 96 çukurlu mikropleytlerdir.

Antikor: IgG fraksiyonlarıdır.

Enzim ve substratlar: Konjugatın işaretlenmesinde en sık kullanılan alkalen fosfataz(AP) ve horseradish peroksidaz (HRP) enzimleridir.

AP için BCIP/NBT ( 5-bromo-4chloro-3-fosfat indolyl/Nitro mavi tetrazolium)

HRP için TMB ( tetramethylbenzidine ) kullanılır.

Yıkama: ELİSA yönteminde her bir safha arasında fosfatlı tampon solüsyonu (PBS) ile yıkama işlemi önemli yer tutmaktadır.

Durdurma: ELİSA’nın son safhası olan ‘reaksiyon durdurulması’ basamağında asidik ve bazik çözeltiler ( H2so2, HCL, NaOH ) kullanılır.

ELİSA Çeşitleri Nelerdir ?

Direkt ELISA
İndirekt ELISA
Sandwich ELISA
Kompetetif ELISA

Direkt ELISA
Direkt ELISA yöntemi yüksek molekül ağırlıklı antijenin miktar tayini için uygundur.
Numune içindeki antijenler nonspesifik olarak mikrotitre kabının kuyu yüzeyine bağlanır.
İşaretli antikor kuyucuklara eklenir.
Belirli sürelerde inkübe edilir.
Yapılan yıkama işlemi ile bağlanmamış işaretli antikorlar ortamdan uzaklaştırılır.
Kuyulardaki bağlanmış enzim işaretli antikor miktarı, ortama enzimin substratının eklenmesi ile oluşan renk değişimi sayesinde belirlenir.

İndirekt ELISA
Numune içindeki antijenler mikrotitre kabının kuyu yüzeyine bağlanır.
İlk olarak işaretsiz primer antikorlar kuyulara eklenir.
Antijen ve primer antikor belirli sürelerde inkübe edilir.
Yapılan yıkama işlemi ile bağlanmayan primer antikorlar ortamdan uzaklaştırılır.
Sonrasında primer antikorlara spesifik, enzim ile işaretli sekonder antikor kuyulara eklenir.
Belirli sürelerde inkübe edilir.
Tekrar yapılan yıkama işlemi ile bağlanmayan işaretli sekonder antikorlar ortamdan uzaklaştırılır.
Son olarak enzimin substratı kuyulara eklenir ve elde edilen renk değişimi ile antikorlar belirlenir.

Nonkompotetif ELISA (Sandwich yöntemi)
Bu test ile bilinmeyen örneklerin içindeki antijen miktarı belirlenir.
Direkt veya indirekt ELISA ile oluşan renk değişimi antikorun varlığına işaret ederken; Sandviç ELISA da oluşan renk değişimi antijenin varlığına işaret eder.

Sandwich ELISA’ da antikorlar (yakalama antikoru) mikrotitre kabının kuyucuklarının katı fazına immobilize edilir.
Antijeni içeren örnek daha sonra ilave edilir ve antijen-antikor kompleksinin oluşması beklenir.
Bağlanmamış proteinler yıkama basamakları ile uzaklaştırılır.
Enzim işaretli ikinci bir antikor (deteksiyon antikoru), yakalama antikoruna bağlanmış antijene farklı bir epitopundan bağlanır.
Bağlanmayan deteksiyon antikorunun yıkama işlemi ile uzaklaştırılmasından sonra, ortama enzime ait substrat eklenir.
Substrat deteksiyon antikoruna bağlı enzimle reaksiyona girerek renk değişimine neden olur.
Bu renk değişimi de spektrofotometre ile ölçülür.

Renkli ürün oluşumu, işaretsiz ligandın (serumdaki antijen veya antikor) konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.
Bu tekniğin ana avantaji, antijenin kullanılmadan önce saflaştırılmasına gereksinim olmamasidir ve sandviç ELISA çok spesifiktir.
Bu tekniğin dezavantaji ise her antikorun kullanılamamasıdır. Seçilen monoklonal antikor kombinasyonları aynı antijen üzerinde üst üste binmeden farklı epitopları tanımalıdır.

Kompetitif ELISA
Mikrotitre kabının kuyucuklarının katı fazına antijen veya antikor bağlanır.
Çukurlara serum ( işeretsiz ligand içerir ) ve reaktif ( işaretli ligand içerir ) eklenir.
İnkübasyon süresince immobilize antijen veya antikora bağlanmak için işaretsiz ligand ile enzim işaretli ligand yarışırlar.
İnkübasyon ve yıkama işleminden sonra substrat eklenir.
Reaksiyon sonucu oluşan renk değişikliği, hasta örneğindeki işaretsiz ligand miktarı ile ters orantılıdır. Örnekte ne kadar az işaretsiz ligand varsa birleşen işaretli ligand miktarı da o kadar fazla olacaktır.
Sonuçlar spektrofotometrik olarak değerlendirilir.

Kompetitif ELISA yöntemi, sıklıkla antikor ölçümünde kullanılmaktadır.

Plazmit DNA İzolasyonu

Sıvı Kültürden DNA İzolasyonu

•    Gece boyu uygun besiyerinde büyüyen kültür oda sıcaklığında 10 000 rpm’de 5 daika santrifüj yapılır.
•     Süpernatanı uzaklaştır   
•   Pellet 250 µl resuspend solusyonunda çöz
•   Üzerine 250 µl liziz solusyonu ekle ve hafifçe karıştır
•   350 µl nötralizasyon solusyonu ekle ve hafifçe karıştır
•   Santrifüj yap (13 000 rpm 5 dakika, oda sıcaklığında)
•       DNA nın spin kolona bağlanması için, süpernanı kolona aktar
•    Santrifüj yap (13 000 rpm 1 dakika, oda sıcaklığında) 
•       Kolon Yıkaması için, 500 µl yıkama solusyonu ekle
•    Santrifüj yap (13 000 rpm 30-60 sn, oda sıcaklığında)
•    Altta kalan sıvıyı uzaklaştır.
•    Spin kolon tekrar boş santrifüj yap (13 000 rpm 1 dakika, oda sıcaklığında
•    DNA yı kolondan indirmek için, spin kolonu yeni ephendorf tüpüne aktar
•   Kolon üzerine 50 µl EB ekle 2 dk oda sıcaklığında inkübe et
•   Santrifüj yap (13 000 rpm 2 dakika, oda sıcaklığında)
•    Altta kalan kısım DNA içerir
•   İzole edilen DNA -20 OC’da saklanmalıdır

PCR (Polymerase Chain Reaction) Polimeraz Zincir Reaksiyonu

PCR (polymerase chain reaction) polimeraz zincir reaksiyonu olarak da adlandırılan reaksiyon için kullanılan cihaza termal döngü cihazı denir. Thermal cycler ya da termal döngü cihazı çalışma prensibi oldukça basittir. Termal döngü cihazı sadece tanımlanan zaman aralığında sıcaklığı değiştirir. Peki bu kadar basit bir işlem nasıl olurda DNA kopyasını oluşturur. PCR cihazını incelemeden önce hücre içinde DNA replikasyonun nasıl olduğunu tekrar hatırlamamız gerekiyor.

Klasik PCR cihazı ya da termal döngü cihazı sadece sıcaklığı değiştiriyor demiştik. Peki ne kadar süre ve kaç derece bu protokol neye göre belirlenir.

Termal döngü cihazı önce 95 C de yaklaşık 5 dakika bekler. Bu bekleme aşamasında cihazın içine konulan PCR tüplerinin içinde bulunan DNA çift zinciri arasındaki hidrojen bağları kopar ve yüksek sıcaklıktan dolayı DNA fragmanları bir araya gelemez.

Daha sonra sıcaklık yaklaşık olarak 50-60 C arasında yaklaşık 1 dakika bekler. Bu bekleme aşamasında PCR tüpünün içinde bulunan ileri veya forward geri veya reverse primerler gidip DNA tekli fragmanındaki karşılığına bağlanır.

Sıcaklık daha sonra 68-72 C arasına getirilip çoğaltılacak olan gen bölgesinin uzunluğuna göre belirlenen bir sürede bekletilir.

Bu işlem bir döngü olarak adlandırılır. Bu işlem ortalama 20 döngü yapılabilir. Daha uzun döngüler DNA polimeraz enziminin hatalı işlem yapmasına neden olabilir.

Daha sonra döngüler bittikten sonra yeni oluşan DNA zincirinin eksik kalan bölgeleri olabilir düşüncesiyle son defa ortalama 68-72 C de yaklaşık 5 dakika bekletilir.

Yeni DNA fragmanları degrede olmaması için işlem bittikten sonra sıcaklık 4 C ye ayarlanır.

Sıcaklık ve sürelerin yaklaşık olarak ifade edilmesinin nedenleri
DNA polimeraz enziminin optimum çalışma sıcaklığı
Primerlerin uzunluğu
Oluşturulacak olan DNA fragmanlarının uzunluğu

PCR cihazının üzerinde bir kapak bulunur ve bu kapakta ısıtma bloğu vardır. Bu kapağın sıcaklığı PCR tüplerine verilen sıcaklıktan daha yüksek olmalıdır. Aksi halde PCR tüpü içindeki sıvı tüpün kapağına buharlaşıp birikir. Böylelikle PCR tüpünün içinde altta kalan kısımda konsantrasyon artar ve PCR işlemi sonucunda Ürünleri görmek için yürüttüğünüz agaroz jelde hayal kırıklığından başka bir şey gözükmez.

Örnek PCR protokolü:

Cins	Stok Konsantrasyon	Alınan Miktar	Son Konsantrasyon
Kalıp DNA’sı	40 ng/ µl	5 µl	250 ng
İleri Primer	10 µM	5 µl	1 µM
Geri Primer	10 µM	5 µl	1 µM
dNTP Karışımı	10 mM	5 µl	1 µM
Reaksiyon Tamponu	10 X	5 µl	1 X
DNA Polimeraz	5 U	1 µl	0,1 U
Deiyonize Su	–	24 µl	–
Toplam	–	50 µl	–
Program	Sıcaklık	Süre	Döngü Sayısı
İlk Denatürasyon	95 oC	5 dakika	1
DenatürasyonBağlanma	95 oC	30 saniye	30
Polimerizasyon	55 oC	30 saniye
	72 oC	1.5 dakika
Son Polimerizasyon	72 oC	5 dakika	1

Tarımsal Biyoteknoloji nedir ? Bu alanda ne iş yapılır ?

Geleneksel ıslah yöntemleri ile yürütülmekte olan çalışmalar geçerliliğini her zaman koruyacaktır ancak genotiplerin ıslahında gelişen ve değişen modern teknolojiler ile yürütülmesi artık kaçınılmazdır. Temel olarak hızla artan dünya nüfusunun yeterli ve dengeli beslenmesini sağlamayı hedefleyen Tarımsal Biyoteknoloji; Bitki ve hayvanlara ait hücre, embriyo, organ kültürleri, genetik yapıların incelenmesi, gen dizilerinin çıkarılması, böylece yeni genotiplerin çıkartılması bu bilgilerin klasik ıslahta kullanılması veya doğrudan gen transferi ile transgenik genotiplerin oluşturulması, özellikle tarımın değişik alanlarında fonksiyon gösteren gıda ve yem endüstrisinden, gübre, tekstil, deterjan sektörüne kadar geniş bir yelpazede kullanılan enzimleri üreten mikroorganizmaların bulunması, genetik olarak tanımlanması, verimin arttırılması için genetik olarak değişikliğe uğratılması gibi tamamen laboratuvar ortamında gerçekleştirilecek uygulamaları kapsamaktadır.